Revoluce v molekulární biologii. Nůžky jménem CRISPR

Pohyblivý obrázek koně vložený do DNA bakterie nebo první pokusy s úpravami genetické informace embrya, to jsou příklady, které spojuje využití takzvané CRISPR-Cas9 metody. Jde o nástroj, který způsobil v molekulární biologii doslova revoluci a podle mnohých ovlivní celou společnost.

Možnosti upravovat genetickou informaci organismů existují už desítky let a mají význam nejen pro základní výzkum, ale otevírají také možnosti například pro nové způsoby léčby dědičných chorob. Manipulace s DNA však byla ještě před pár lety náročná finančně i technicky a zásahy do DNA byly navíc často náhodné.

Před pěti lety však vědci přišli s novou metodou CRISPR-Cas9 a oba tyto problémy v podstatě odbourali. „Je to tak jednoduchá a levná technologie, že s ní může pracovat téměř každá laboratoř. Díky tomu se skokově posunul výzkum v mnoha oblastech. Využití této metody se testuje i v medicíně a už probíhají také klinické studie, které jsou na ní založené,“ uvedl Michal Šmída, který se v Ceitecu Masarykovy univerzity zabývá hledáním nových možností léčby nádorových onemocnění a metodu využívá.

Za převratnou metodu vědci vděčí bakteriím. Právě jejich obrana vůči bakteriofágům, tedy virům, které je napadají, tvoří její základ. „Velmi jednoduše řečeno, když se DNA fága dostane do bakteriální buňky, tak je bakterie schopná její část začlenit do svého genomu a vytvořit takzvaný Crispr lokus. Když pak dojde k opakované infekci, bakterie informaci uloženou v CRISPRu využije a vytvoří s její pomocí konstrukt, který napadne DNA infikujícího fága a za pomoci enzymu nazývaného nukleáza Cas9 ji v určitém místě rozštěpí a fága tak zahubí,“ popsal základ metody Jiří Doškař z Ústavu experimentální biologie Přírodovědecké fakulty MU.

Principu metody CRISPR-Cas9 lze využít univerzálně pro cílené zásahy do genomu všech organismů, nejen bakterií, ale i rostlin a živočichů. CRISPR-Cas9 umí v genetické informaci organismů vyhledat konkrétní místo a v tomto místě DNA přerušit. Proto se někdy princip této metody označuje jako molekulární nůžky. V buňce se spustí opravné mechanismy, které DNA opět spojí, ale nedokonale. Tak vznikne mutace, která například vyřadí z činnosti zasažený gen.

„Je také možné přidat k tomuto systému jinou DNA, například další gen nebo regulační sekvenci, která se do cílového místa vloží a pak umožní aktivitu určitého genu jen utlumit, nebo naopak zesílit,“ doplnil Doškař.

Ničení nádorů

Široké využití metody umožňuje mimo jiné to, že je kompletně zmapována řada genomů včetně lidského. Vědci tak mají k dispozici knihovny se sekvencemi RNA, které cílí na konkrétní místo v genetické informaci. „Umožňuje nám to jednoduše a rychle vytvořit buněčné linie, které mají umlčené geny, které chceme studovat. Můžeme také do buněk vnášet mutace, které se vyskytují u některých pacientů a projevují se jako změny ve funkci nějaké bílkoviny,“ popsal možné využití metody Šmída.

Jeho tým využívá takto pozměněné buněčné linie především ke studiu chronické lymfocytární leukémie, s níž je spojována celá řada mutací, ale není jasné, jak přesně ovlivňují buňky.

„Metodu využíváme také pro takzvaný screening. Člověk má asi dvacet tisíc genů, které umíme umlčet. Vytvoříme tak populaci buněk, kde má každá buňka vyřazený jeden gen z funkce, a my sledujeme, které z nich jsou nezbytné pro život a po jejichž vyřazení buňka zahyne. Právě to by se dalo využít pro cílené zasažení nádorových buněk,“ přiblížil možné využití v léčbě molekulární biolog.

Geneticky modifikované organismy

Práci s metodami, jako je CRISPR-Cas9, musí odborníci oznamovat Ministerstvu životního prostředí. Výsledkem jejího použití jsou totiž geneticky modifikované organismy (GMO). „U těchto postupů se hodnotí riziko, které vychází z toho, jaká metoda se používá, u kterého organismu, o jakou genetickou modifikaci jde a jakým způsobem se do buněk vpravuje původce genetické modifikace. Potřebný je také provozní řád a havarijní plán, kde je popsáno nakládání s GMO, jak se brání jejich případnému úniku z laboratoře a jak se likvidují,“ uvedl Doškař, který je pověřenou osobou pro oblast GMO na Masarykově univerzitě.

Na Masarykově univerzitě se tato metoda využívá k modifikaci rostlinných a živočišných buněk a také bakterií. Právě jimi se Doškař zabývá. „Metodu můžeme využít například k tomu, abychom v bakteriích utlumili aktivitu genů zodpovědných za jejich patogenitu nebo připravili očkovací kmeny, které vyvolají imunitní reakci organismu, ale nebudou schopné vyvolat infekci,“ přiblížil Doškař.

Pozor si musí dát výzkumníci také na to, jaké organismy budou touto metodou upravovat. „Pokud se výzkum provádí na lidech nebo na lidských buňkách, musí jej předem schválit etická komise,“ připomněla předsedkyně univerzitní Etické komise pro výzkum Renata Veselská.

Revoluce u rostlin

Obrovský dopad má pak metoda CRISPR-Cas9 pro výzkum rostlin. „Bez ní bychom neměli nástroj, jak cíleně modifikovat genom u rostlin. Před tím nám dalo hodně práce vytvářet linie rostlin s nějakou mutací a zaměřovali jsme se na modelové rostliny s malým genomem. Teď můžeme zkoumat v podstatě jakoukoliv rostlinu,“ zdůraznil Karel ŘíhaMendelova centra genomiky a proteomiky rostlin v Ceitecu.

Největší dopad to podle něj bude mít na rostlinné biotechnologie a zemědělství. „Má to ale stále svá úskalí, která jsou mimo jiné legislativní. V České republice spadá tato metoda a její výsledky do kategorie GMO, jejichž využívání je v Evropské unii silně omezené. Podle mě přitom není důvod využívání této techniky u rostlin za GMO považovat,“ tvrdí Říha.

CRISPR-Cas9 totiž nemusí vnášet do genetické informace cizorodou DNA, ale jen v ní vytvoří mutaci za pomoci jejího rozštěpení. „Díky Crisprům můžeme ovlivnit konkrétní místo v DNA a budeme přesně vědět, jaký efekt to přinese. Přitom například běžně používané ozařování semen rostlin, které způsobuje neznámé mutace na mnoha místech v DNA, do kategorie GMO nespadá,“ poukázal na jeden z důvodů, proč by se podle něj měla pravidla pro využívání CRISPR-Cas9 u rostlin uvolnit.

Kde jsou hranice

Přísnější je Říha ale v otázkách manipulace s lidskou DNA. „Pokud tuto metodu využijeme pro genovou terapii, při níž se pozmění DNA konkrétního pacienta a ten se vyléčí, bude zřejmě vše v pořádku. Pokud ale budeme upravovat DNA v embryích, vytvoříme dědičnou změnu. Je otázka, zda vůbec máme něco takového dělat. Začneme s opravou devastujících dědičných onemocnění, ale za pár let se mohou společenské standardy posunout a nebude neetické upravovat například barvu očí,“ poukázal na složité dilema Říha.

Šmída tak přísný není, i když testy na embryích také považuje za předčasné. Velký potenciál vidí v možnosti zbavit se některých závažných dědičných chorob. „Jde ale o to, do jaké míry dnes známe dlouhodobé dopady použití metody CRISPR-Cas9. Vnesený enzym může rozštěpit DNA i na jiném místě a je tedy riziko, že v ní způsobíme změny, které za pár let mohou vyústit třeba v rakovinu. Je tedy třeba ještě hodně výzkumů a testů, než se můžeme o něco takového pokusit.“

Masarykova univerzita | Masaryk university