online.muni.cz Přejít na hlavní obsah

Jak luminiscence osvětluje vědcům cestu vpřed

Metoda Brainbow (Brain = mozek, rainbow = duha) významně pomáhá ve studiu nervových spojení v mozku. Individuální neurony v mozku i jinde od sebe mohou být rozlišeny s využitím fluorescenčních proteinů. Neurony náhodně exprimují různé poměry červených, zelených a modrých derivátů GFP (zeleného fluorescenčního proteinu), což jim dá různé odstíny.

Bioluminiscence, světlo vznikající chemickými reakcemi v živém organismu, okouzlila mnoho z nás. Schopnost živočichů vydávat světlo v různých barvách je nejen krásná a zajímavá, je také užitečná. Organismům, které lumineskují, pomáhá při lovu, obraně nebo páření. Lidem pak pomáhá ve vědě. Na jejím využití je založeno hned několik zajímavých metod.

Bioluminiscence je forma luminiscence (světélkování), při níž je energie dodávána chemickou reakcí v živých organismech. Ve vědě často využíváme fluorescenci, při níž je nejdříve dodána energie elektromagnetickým zářením, tedy světlem. Energie z dopadajícího světla takzvaně excituje elektron, který dočasně přejde na vyšší energetickou hladinu. Při návratu na původní hladinu vyzáří energii ve formě světla. Čím víc energie vyzáří, tím bude vlnová délka světla kratší a bude blíže k modrému konci spektra, naopak málo energie znamená spíše dlouhovlnné červené světlo.

Využití v mikroskopii

Využití luminiscence je poměrně různorodé. Využíváme ji v zobrazovacích metodách, například v mikroskopii, ke zviditelnění buněk nebo jejich částí. Dále si můžeme buňky označit fluorescenční značkou a pak je třídit. Můžeme taktéž měřit množství světla, například pro měření aktivity bakterií v ekotoxikologických testech.

Zobrazovací metody jsou asi nejrozšířenější luminiscenční metodou. Fluorescenční barviva, tvz. fluorofory, buď pronikají přímo do buňky, samy se váží na její povrch nebo je používáme navázané na protilátky, které se specificky váží na strukturu, která nás zajímá. Tím získáme informace o umístění a rozložení sledovaných buněk či proteinů.

Jakmile máme fluorofor navázaný, stačí už jen na vzorek správně posvítit a mít fluorescenční mikroskop. To nám umožní vidět světlo všude tam, kde se fluorofor navázal, a vidíme tak buď tvar nějaké struktury, nebo například množství buněk určitého typu a jejich rozložení. Obsahuje-li buňka přírodní barvivo, obejdeme se i bez fluoroforů – například chlorofyl svítí pod UV červeně.

Na tomto obrázku můžeme vidět spinální ganglion, tedy zauzliny na zadních kořenech míšních nervů. Fialově jsou označené neurony a jejich axony (výběžky, pomocí kterých komunikují), zeleně pak byly označeny buňky tvořící krevní cesty. Výsledný obrázek nám poskytne informaci o množství cév a jejich rozložení.

Další často využívanou zobrazovací metodou je metoda reportérového genu, která je hojně využívána v genetickém inženýrství.

Princip spočívá v začlenění genu pro fotoprotein za tzv. promotor jedné z několika kopií genu, který nás zajímá. Promotor je součástí každého genu a můžeme si ho představit jako název kapitoly v knize, podle které poznáme, odkud ji máme začít číst.

Jakmile tedy buňka začne přepisovat náš gen zájmu, začne zároveň i lumineskovat a my víme, že náš gen je aktivní. To nám může pomoci s určením genů, které se podílí na nějakém procesu, ať už výhodném nebo defektním, nebo například identifikovat populaci buněk v tkáni.

Třídění buněk

Kromě zobrazení sledovaných struktur můžeme značky využít i k analýze a třídění buněk. K tomu potřebujeme průtokový cytometr, který nám umožňuje buňky počítat, analyzovat i třídit. K tomu je nutné mít buňky v suspenzi, aby mohly procházet přístrojem po jedné. Bez označení lze analyzovat velikost a organizaci buněk, případně může mít buňka nějaký vnitřní fluorofor - např. hemoglobin červených krvinek. Fluorescenční značky nám však umožní zjistit i to, zda je buňka živá, podle množství DNA určit v jaké fázi buněčného cyklu se nachází nebo identifikovat určitou buněčnou populaci.

V ekotoxikologii nebo i v imunologii jsou často využívány metody detekující množství vyzářeného světla. Pro tyto metody jsou využívány bioluminiscenční bakterie a jedná se snad o jediný případ, kdy využíváme celý organismus, ne jen jeho gen či fotoprotein. V ekotoxikologii je využíváme pro testování toxicity látek. V imunologii pomocí nich můžeme testovat zdatnost imunitních buněk fagocytovat neboli pohlcovat cizí částice. V obou případech pak sledujeme vyhasínání luminiscence ve vzorku, což značí, že bakterie umírají nebo jsou pohlcovány.

Rod Photobacterium je jeden ze 4 hlavních lumineskujících rodů bakterií. Většina bakterií svítí modrozeleně až modře.

Kromě bakterií je v imunologii využíván i fotoprotein pholasin objevený u zástupců rodu Pholas z kmene měkkýšů. Pholasin je využíván k detekci produkce volných radikálů, které oxidují molekuly ve svém okolí, a způsobují tzv. oxidační stres. Ten může poškozovat DNA, proteiny i další součásti buňky. V organismu jsou radikály mimoděk produkovány při běžných pochodech v buňce, ale imunitní buňky ho produkují účelně ve snaze zabít bakterie.

Pokud se ve vzorku pholasin setká s radikály, je oxidován a emituje modrozelené světlo. Podle množství světla můžeme usoudit na poměr oxidujících látek u různých vzorků nebo naopak jejich antioxidační kapacitu – schopnost radikály vychytávat. Dalším využitím je sledování antimikrobiální aktivity krve, zejména u sportovců připravujících se na důležitý závod. Bílé krvinky začnou produkovat radikály jako obranu a díky jejich přítomnosti se můžeme dozvědět, že člověk je nemocný ještě dřív, než to sám na sobě pocítí.

Luminiscence nám zkrátka může odpovědět na spoustu otázek o našich vzorcích, o organizaci buněk či tkání a dokonce nám dokáže říct, že jsme nemocní ještě dřív, než to poznáme my sami. A to vše díky pozorování a využití organismů, které umí něco, co my samotní ne, a svítí nám tak na cestu k pokroku a poznání.

Masarykova univerzita | Masaryk university